بررسی اثرات ضدعفونی کنندگی بذر با نانو ذرات نقره بر همزیستی میکوریزایی و مرفولوژی ریشه جو در تنش خشکی

مقدمه

خشکی از عمده ترین خطرات برای تولید بهینه محصولات زراعی در ایران و جهان است. ایران با متوسط نزولات آسمانی 240 میلیمتر جزء مناطق خشک جهان طبقه بندی می گردد. بالا بودن مقدار تبخیر و تعرق، محدودیت منابع آبی و سایر عوامل باعث توجه بیشتر به مطالعه اثرات تنش خشکی و انتخاب ارقام مقاوم به خشکی شده است. زمان وقوع و مدت زمان دوام تنش، خصوصیات ذاتی خاک، ‌تغییرات و نوسانات بارندگی همگی بر مقاومت به گیاه خشکی اثر دارند (آرنون آی، 1365).

استفاده از کودهای شیمیایی نه تنها عامل افزایش هزینه تولید است. بلکه خطر آلودگی آب های زهکشی و انباشت آنها در خاک های زراعی را افزایش می دهد. از سوی دیگر، کودهای میکرو عمدتاً دارای مقادیر قابل توجهی از عناصر نادر، هستند که انباشت آنها در خاک در طی مصرف بلند مدت کودها عامل آلاینده مهمی در خاک های کشاورزی هستند ,1997) Raven and Leoppert). تغییر در نسبت وزن خشک ریشه به اندام هوایی یا تجمع موقتی ذخایر در ساقه تحت شرایط کمبود آب، با تغییر در متابولیسم کربن و نیتروژن همراه می شود (Rodrigues et al,1995). نظر به اهمیت کاربردی نانو ذرات نقره در ضد عفونی بذری، در ارتباط با مکانیسم عمل آن دو نکته در نظر گرفته شده است:

1- مکانیسم یونی: در این مکانیسم ذرات نانو نقره فلزی به مرور زمان، یونهای Ag⁺ را از خود ساطع می کنند. این یونها طی واکنش جانشینی، باندهای Hs^- را در جداره میکروارگانیسم ها به باندهای Ags^- تبدیل می کنند که نتیجه این واکنش تاتوره شدن و تلف شدن میکروارگانیسم ها است.

2- مکانیسم کاتالیستی: این مکانیسم بیشتر در مورد کامپوزیت های نانو نقره- سمی کانداکتورها صدق می کند. ذرات نانو نقره روی پایه های نیمه هادی مانند Tio₂یا Sio₂ قرار گرفته می شوند. در این حالت پایه های نیمه هادی بدون نیاز به انرژی نور به دلیل کاهش سرعت الکترون ها بین لایه ظرفیت و لایه هدایت اتم به حالت پایداری از حضور ذرات پروتون و تراکم الکترون می رسند، در این وضعیت ذره، مانند یک پیل الکتروشیمیایی عمل می کند و با اکسید کردن اتم O₂ و با هیدرولیز H₂O، یون OH⁺ را تولید می کنند که هر دو از بنیانهای فعال در گروه اکسیژن فعال هستند که از قویترین عاملین ضد میکروب نیز می باشند (سایت مورد استفاده).

فرضیه ای مبنی بر عدم تاثیر نانوذرات بر گیاهان وجود داشت، به دنبال آن پژوهش هایی توسط  Yang وWatt  در سال 2005 صورت گرفت که اثر غلظت های مختلف نانو ذرات اکسید آلومنیوم را در محیط کشت هیدروپونیکی بر 5 گیاه کلم، هویچ، ذرت، کدو و سویا بررسی کردند، در هر 5 مورد غلظت 2 میلی گرم در هر لیتر، کاهش معنی داری در رشد ریشه نشان داد. در حالی که در غلظت های کمتر، این مورد مشاهده نشد. همچنین نانو ذرات دی اکسید سیلیکون رشد ریشه را افزایش داده و در ضدعفونی بذر نقش دارد (Watt and Yang,2005).

 همچنین مطالعاتی با هدف دستیابی به اثرات سمیت گیاهی نانو ذرات آلومنیوم، اکسیدآلومنیوم، روی و اکسیدروی بر جوانه زنی و رشد ریشه 6 گیاه (تربچه، کلزا، چاودار، کاهو، ذرت و کدو) بررسی شد. نتایج نشان داد، نانو ذرات روی و اکسید روی مانع جوانه زنی و رشد ریشه و از بین رفتن میکروارگانیسم های خاک می شود. در حالی که نانو ذرات آلومنیوم و اکسید آلومنیوم هیچ تاثیری بر رشد کدو نداشتند ولی رشد تربچه و کلزا را افزایش و طویل شدگی ریشۀ چاودار و کاهو را به طور معنی داری کاهش داد (Michae , 2007). وزیکولار ¹(VAM)، آرباسکولار ²(AMF) مایکوریزا یکی از متداول ترین همزیستی های مایکوریزی در گیاهان می باشند که همزمان با اولین گیاهان خشکی زی در پانصد میلیون سال پیش ظاهر شدند. VAM از انواع مایکوریزایی است که در اغلب اکوسیستم های کشاورزی و منابع طبیعی یافت می شود. AMF با اغلب گونه های گیاهی همزیست شده و در تنوع گیاهان، رشد و حاصلخیزی آنها اهمیت دارند (Rosendahl and Stukenbrock, 2004).

قارچ های میکوریزا بر اساس نقش خود به عنوان رابط بین خاک و گیاه در تغذیه گیاهان، از اهمیت زیادی برخوردار می باشند. میکوریزها به همان میزان که در انتقال مواد غذایی بین گیاه و خاک دخالت دارند، می توانند یک عامل محافظت کننده خاک نیز محسوب شوند,2002) (Borkowska

مواد و روش ها:

این تحقیق به منظور بررسی تاثیر نانو ذرات نقره جهت ضدعفونی بذر و این که آیا ضدعفونی بذر با نانو نقره، همزیستی قارچ با ریشه گیاه را تحت تاثیر قرار می دهد، به صورت آزمایش فاکتوریل بر مبنای طرح کاملاً تصادفی در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی صورت گرفت. ضدعفونی بذور دو ژنوتیپ جو (معمولی و بدون پوشینه ) با غلظت های مختلف نانو ذرات نقره (صفر (شاهد)،50 و ppm 100 و قارچ کش) که به ترتیب با (C1،  C2،C3 و C4) در دو مرحله جوانه زنی  و کشت در گلدان  انجام شد.

در مرحله جوانه زنی، بذور جو با غظت های مذکور نانو نقره ضدعفونی شد و جهت ارزیابی فشار اسمزی با غلظت های مختلف پلی اتیلن گلیکول با فشار اسمزی (bar15- و10- ، 5- ،0) تیمار دهی شد(Pteltd,2006) و به مدت هفت روز در اتاقک کشت با دمای 20 درجه سانتیگراد قرار گرفت، سپس به صورت روزانه، درصد جوانه زنی و در نهایت در روز هفتم، طول ساقه چه، ریشه چه، وزن خشک ساقه چه و ریشه چه اندازه گیری گردید.

در مرحله بعد بذور ضدعفونی شده به گلدان هایی با ماسه استریل در دو سطح حضور و عدم حضور مایه تلقیح میکوریزایی کشت شد. سپس با محلول غذایی هوگلند با فشارbar 5- =ψ حاصل از محلول پلی اتیلن گلیکول محلول دهی شد (Michael ,1983). بعد از نمونه گیری در هر مرحله، طول ریشه و اندام هوایی، درصد همزیستی، وزن خشک ریشه و اندام هوایی محاسبه گردید. تراکم میکوریزایی بر اساس روش تلاقی خطوط شبکه ((Gridline intersect method انجام شد(Grace and Stribley, 1991).

   بدین ترتیب که ریشه ها پس از شستشو در هیدروکسید پتاسیم 10درصد و اسیدی شدن در کلرید هیدروژن 1 درصد با تریپان بلو01/0 درصد در گلیسرول اسیدی شده رنگ آمیزی شد. قطعات 1 سانتی متری ریشه در صفحات مدرج 1 سانتی متر در 1 سانتی متر با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 مشاهده شد و درصد همزیستی بر اساس حضور وزیکول ها و هیف های میکوریزایی محاسبه شد. در نهایت داده ها از نظر آماری با نرم افزار SAS تجزیه و تحلیل شد.  

نتایج و بحث:

اثر ضد عفونی بذور جو با نانو ذرات نقره در مرحله جوانه زنی:

در غلظت ppm 50 نانو ذرات نقره ژنوتیپ جو بدون پوشینه با 84 درصد، بیشترین درصد جوانه زنی را نشان داد که در سطح 5% معنی دار بود (شکل 1ب). نتایج تجزیه واریانس نشان داد که در بذور ضدعفونی شده با قارچ کش، درصد جوانه زنی به طور معنی داری کاهش یافت (جدول1).

بررسی اثر فشار اسمزی در غلظت های مختلف پلی اتیلن گلیکول بر درصد جوانه زنی، نشان داد که ضدعفونی ppm50  نانو نقره در تیمار شاهد، با 92 درصد بیشترین درصد جوانه زنی را داشت. در فشار اسمزی بالای پلی اتیلن گلیکول( bar15-) ضدعفونی بذر با غلظت ppm 100نانو نقره، درصد جوانه زنی کاهش معنی دار بود و کمترین درصد جوانه زنی در ضدعفونی مرسوم با قارچ کش رورال تی اس مشاهده شد(شکل 1الف).

Zeng و همکاران (2005) در بررسی اثرات نانو اکسید تیتانیوم در غلظت های 25/0 درصد تا 4 درصد بر جوانه زنی و رشد بذور اسفناج مشاهده کردند، در غلظت 25/0 درصد نانو اکسید تیتانیوم در طی مراحل مختلف رشد، وزن خشک گیاه، سنتز کلروفیل، فعالیت روبیسکو، نرخ فتوسنتزی و متابولیسم نیتروژن افزایش می یابد.

نانوذرات با اندازه حدود 8 نانومتر توانایی نفوذ به غشاء زیستی را دارد و با تاثیر بر دیواره سلولزی در انتقالات یونی در غشاء سلولی گیاه ایفای نقش می کند(Michae,2007) . همانطور که در جدول تجزیه واریانس نشان داده شد اثر متقابل خشکی و غلظت های مختلف ضدعفونی بذری بر طول ریشه چه و ساقه چه در سطح احتمال 1 درصد معنی دار بود (جدول1). همچنین برهم کنش ژنوتیپ و تیمارهای ضدعفونی بذری بر طول ریشه چه در سطح احتمال 1 درصد از نظر آماری معنی دار بود ولی بر طول ساقه چه معنی دار نبود (جدول1). در مرحله جوانه زنی، ارزیابی اثر متقابل غلظت های مختلف پلی اتیلن گلیکول با تیمارهای ضدعفونی بذری نشان داد که کمترین تعداد ریشه غیر نرمال در ضدعفونی بذور جو با قارچ کش رورال تی اس مشاهده شد (شکل2). samarbakhsh و همکاران (2009) گزارش کردند که برخی ضدعفونی های بذری کاهش معنی داری در رشد گیاه دارد که به نوع تیمار ضدعفونی کنندگی بذری ، نوع گیاه و مرحله رشدی بستگی دارد. مطالعات دلالت به این دارد که یون های نقره با گروه های سولفید هیدروژن پروتیین ها در بازهای DNA برهم کنش دارد، به طوری که منجر به جلوگیری از تنفس یا باز شدن مارپیچ DNA می شود(Batarseh,2004). Russel  و Hugo در 1994 در رابطه با نقش ذرات نقره به ممانعت از تقسیم سلولی و تخریب پوشش سلولی در میکروارگانیسم ها اشاره کردند که این مسئله در مورد کشت بذر در خاک صادق است.

اثر ضد عفونی بذور جو با نانو ذرات نقره بر همزیستی میکوریزایی:

بیشترین وزن خشک ساقه در بذرهای ضدعفونی شده با ppm50 نانو ذرات نقره و در فشار اسمزی صفر مشاهده گردید که در مقایسه با سایر تیمارهای ضدعفونی بذری، این اختلاف معنی دار می باشد. در حالی که ضدعفونی بذری با قارچ کش در فشار اسمزی صفر، وزن خشک ریشه کاهش معنی دار یافت، در حالی که ضدعفونی با نانو ذرات نقره در غلظت ppm100 وزن خشک ریشه افزایش معنی دار داشت (شکل4). قارچ کش ها و ضدعفونی های بذری از جمله نانو نقره می تواند فعالیت مایکوریزا در خاک را تحت تاثیر قرار دهد و بدین ترتیب اثرات نامطلوبی بر جوامع میکروبی خاک خواهد داشت .(Miransari et al., 2006-2009)

Zhang  و همکاران در 2006 گزارش کردند مصرف غلظت های زیاد ضدعفونی بذری می تواند نسبت همزیستی گیاه با قارچ را کاهش دهد. برهم کنش گونه های مختلف مایکوریزایی با قارچ کش های مختلف متفاوت است، به طوری که استفاده از قارچ کش ها ، فعالیت قارچی را تحت تاثیر قرار داده و سبب افزایش کارایی جوانه زنی بذر در زمین و سبز شدن شوند(Murillo-Williams and Pedersen, 2008). حفظ جوامع میکروبی مفید در خاک و افزایش همزیستی میکوریزا با گیاه در کشاورزی پایدار بطور قابل توجهی اهمیت دارد(Schweiger et al., 2001).

در تیمار قارچ کش و در فشار اسمزی bar 5–  طول ریشه درحدود 4/11 سانتیمتر افزایش یافت که از نظر آماری معنی دار بود. در حالی که در غلظت ppm 100 نانو نقره، طول ریشه و ساقه به ترتیب با 49/7 سانتیمتر و62/5 سانتیمتر کمترین اندازه را داشتند و از لحاظ آماری معنی دار نبود (شکل3) ( جدول2). نانو ذرات نقره در غلظت های کم نقش ضد میکروبی دارند. نانو ذرات نقره به تنهایی عمل نمی کنند بلکه فعالیت ضد میکروبی آنها حاصل اثر متقابل نانو نقره بر دیواره سلولی میکرو ارگانیسم ها ،توقف رشد و مرگ سلولی می باشد و این مکانیسم به غلظت یون های نقره و حساسیت گونه های میکوریزی و میکروبی خاک مربوط می شود (karimi et al,2012). گیاهان میکوریزی تجمع وزن خشک اندام هوایی را نسبت به گیاهان بدون میکوریز به میزان بالایی تحریک می کنند (محمودی و همکاران،1382). تشکیل کلونی ریشه با قارچ های میکوریزا، حاصلخیزی گیاهان زراعی را در تنش خشکی افزایش داده و بدین ترتیب به تنش خشکی مقاوم می شوند (Ghazi et al,2004).

  میکروارگانیسم ها با فراهم کردن سطح اضافی جذب، سبب افزایش جذب عناصر غذایی به ویژه فسفر شده و به این ترتیب تولید اسمیلات را افزایش می دهند و سبب رشد و افزایش وزن خشک گیاه می گردند (شیرانی راد و همکاران، 1379). اثر تیمارهای ضدعفونی بذری در همزیستی میکوریزایی معنی دار می باشد به طوری که در تیمارهای ppm 50 نانو نقره و در همزیستی با میکوریزا، طول ساقه با 7/6 سانتیمتر افزایش، معنی دار بود. همچنین نسبت طول ساقه به ریشه نیز افزایش معنی داری را نشان داد (شکل 5). تنش خشکی در همزیستی میکوریزایی اثر معنی داری در طول ریشه و ساقه داشت که در جدول تجزیه واریانس نشان داده شد (جدول1).

درهمزیستی میکوریزایی در پتانسیل فشار bar 5–  طول ریشه با 6/9 سانتی متر افزایش معنی داری یافت(شکل3). در شرایط بدون تنش و در همزیستی با میکوریزا، وزن خشک ریشه افزایش یافت ولی این افزایش از نظر آماری معنی دار نبود(شکل4). قارچ های مایکوریزی با آزاد ‌سازی هورمون های گیاهی از جمله سیتوکنین، رشد گیاهان و جذب عناصر به ویژه فسفر را تحت تاثیر قرار می دهد. میکوریزایی شدن، جذب عناصر را از طریق تغییر در مرفولوژی ریشه متاثر می سازد. این همزیستی عمدتاً منجر به تغییراتی در قدرت پروتون زایی ریشه و درنتیجه pH ریزوسفر می شود(Marschner and RÖmheld,1983).

 همچنین نسبت طول ساقه به ریشه در رقم صحرا و در ppm 50 نانوذرات نقره افزایش معنی داری داشت (شکل 5). نانو ذرات در تحریک رشد رویشی و تسهیل در جذب عناصر میکرو به ریشه گیاهان نقش دارند. بدین ترتیب منجر به افزایش رشد و عملکرد گیاهان زراعی می شوند. محلول NPK (ازت ، فسفر و پتاس) با نانو ذرات  باعث افزایش سطح جذب مواد غذایی و تحریک رشد و نمو در گیاه می شود و بدین گونه با افزایش تولید و کیفیت ویژگی خاک، تسهیل کننده رویش گیاهان می باشند (Pteltd ,2006).

تراکم میکوریزا:

ضدعفونی بذری بر تراکم میکوریزا تأثیر گذاشت به طوری که ضدعفونی مرسوم با قارچ کش باعث کاهش معنی دار تراکم میکوریزا شد، اما بین غلظت های ضدعفونی با نانو نقره تفاوت معنی داری مشاهده نشد (شکل 6).

همانطور که شکل 6 نشان داد، در تنش خشکی، در غلظت ppm 100 نسبت به  ppm50 تراکم میکوریزایی کاهش معنی داری یافت. کمترین تراکم میکوریزایی در ضدعفونی بذر با قارچ کش مشاهده شد که به نظر می رسد قارچ کش، جمعیت قارچ های میکوریزایی خاک را تحت تاثیر قرار داد. در گیاهان همزیست با مایکوریزا، توانایی در جذب مواد غذایی و تحمل در مقابل تنش های زیستی و غیرزیستی افزایش یافت. قارچ ها خود به فرآورده های فتوسنتزی گیاهان نیاز دارند بنابراین قارچ های مایکوریزا با افزایش جذب آب و عناصر غذایی باعث افزایش فتوسنتز، تولید اسمیلات و در نهایت بهبود رشد گیاه می شوند (Talukdar and Germida ,1995).